测序常见问题

1. 对于测序用的DNA样品要求有哪些?

A)，菌液：请提供～1.2ml的新鲜菌液装在离心管中并封好，我们会直接进行质粒提取。

B)，质粒：要求样品浓度>50ng/ul, 提供10ul以上。OD260/OD280=1.8-2.0, OD260/OD230=1.6-2.0；

C）PCR产物：请随样品提供电泳胶图，确定PCR产物为单一扩增条带，方可提供。 若提供已纯化好的PCR产物，条带必须单一，OD260/OD280=1.8-2.0, 最好溶解在已灭菌的去离子水中。浓度要求>10ng/ul，提供10ul以上。

D），RCA样品：请随样品提供电泳胶图。为保证测序质量，请您提供原液时一定要进行鉴定，每次应有阳性对照样品，以免耽误您的实验。

2. 对于测序用的引物要求有哪些?

为了保证测序质量，测序用引物的要求较高，引物的3’端必须与模板完全匹配。用于测序的引物一定要经过PAGE纯化，纯度应>90%，溶解在 已灭菌的去离子水中。此外，测序引物长度最好在17-24bp，GC含量在50-60%左右。请一定在测序单上详细填写好提供引物的浓度。

3. 一般测序的周期有多长?

正常工作日最佳收样时间：8：00-11:00；当日即可获得测序结果；若12:00之后送样，第二天获得测序结果；菌液和PCR未纯化样品，执行周期最迟约48小时后发送测序结果。 3730XL测序仪的有效测序长度是多长

正常情况下，3730XL DNA Analyzer至少保证800bp的有效测序长度。测序完成后，我们会对每个样品提供一份测序报告，其中包括：测出的序列彩峰图和序列文件；在进行DNA测序时，紧邻引物的20-40bp测序准确性偏低。

4. 哪些情况测序结果不到800bp还可能照常收费，为什么?

出现DNA模板上的特殊结构，比如：G/C rich; Poly A/T/C/G连续结构等，将会出现测序反应中断无法进行测序的情况；另外，若DNA模板结构中的重复序列，致使测序引物和模板之间有两个以上的结合位 点，将会产生反应中途出现套峰现象。类似以上情况由于DNA结构原因造成无法正常进行DNA测序，我们会根据具体测序结果进行相应收费。

5. 测序结束后样品能返回吗?

测序结束后，我们保存相关样品15天。若有返还样品要求，请在样品信息单的备注里说明或者及时与我们联系。

6. 测序结果出现套峰的原因是什么?

在测序反应中，模板或引物的原因都可以成套峰的形成。归结有以下几点原因：

A)，测序引物在模板上有两个结合位点；

B)，模板不纯，若是质粒或菌液，原因是非单克隆；若是PCR产物，原因是非特异性条带；

C)，模板序列的特殊结构：比如poly或者发夹结构等；

D)，引物降解，引物不纯，或者引物的特异性差。

7. 片段分析（如SSR,STR等）样品如何做？

测序仪标准校正荧光是6-FAM, VIC, NED,PET四种，仪器中心提供GeneScan-500LIZ和GeneScan-1200LIZ Size Standard。样品稀释和配置都有实验室独立完成，试剂由仪器中心提供，登记即可。如有测试需求或特殊需求请提前和我们联系。

8. 如果有大量样品需要测序或片段分析怎么办？

如果有超过30个以上的样品需要测序或片段分析，请提前和我们联系，为了方便登记和测序，我们提供96孔板和电子登记表格。